還原型谷胱gan肽（reduced glutathione, GSH）試劑盒說明書

微量法 100T/96S

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

GSH 是細胞內最主要的抗氧化巰基物質，在抗氧化、蛋白質巰基保護和氨基酸跨膜運輸等中具有重要作用。還原型與氧化型比值（GSH/GSSG）是細胞氧化還原狀態的主要動態指標。因此，測定細胞內GSH和GSSG 含量以及GSH/GSSG 比值，能夠很好地反映細胞所處的氧化還原狀態。

測定原理：

DTNB 與GSH 反應生成復合物，在 412nm 處有特征吸收峰；其吸光度與GSH 含量成正比。

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組成：

自備儀器和用品：

低溫離心機、水浴鍋、可調節移液器、可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96 孔板、和蒸餾水。

具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數量（10⁴ 個）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1ml 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 8000g， 4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。

3. 血清等液體：直接測定。

GSH 測定操作：

1. 分光光度計/酶標儀預熱 30min，調節波長到 412 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑二置于 25℃（一般物種）或者 37℃（哺乳動物）水浴中保溫 30min。

3. 空白管：取微量玻璃比色皿或 96 孔板，依次加入 20μl 蒸餾水，140μl 試劑二，40μl 試劑三，混勻靜置

2min 后測定 412 nm 吸光度A1。

4. 測定管：取微量玻璃比色皿或 96 孔板，依次加入 20μl 上清液，140μl 試劑二，40μl 試劑三，混勻靜置

2min 后測定 412 nm 吸光度A2。

注意：空白管只需要測定一次。

GSH 含量計算公式：

GSH 標準曲線公式：y=1.5 x（x 為GSH 濃度，μ mol /ml；y 為吸光值）

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按蛋白濃度計算

GSH（μ mol/ mg prot）=(A2－A1) ÷1.5×V 樣÷（V 樣×Cpr） =0.667×(A2－A1) ÷Cpr

（2） 按樣本質量計算

GSH（μ mol/g 鮮重）=(A2－A1) ÷1.5×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W)=0.667×(A2－A1) ÷W

（3） 按細胞數量計算

GSH（μ mol /10⁴ cell）=(A2－A1) ÷1.5×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×細胞數量)=0.667×(A2－A1) ÷細胞數量

（4） 按液體體積計算

GSH（μ mol/ ml）=(A2－A1) ÷1.5×V 樣÷V 樣 =0.667×(A2－A1)

V 反總：反應總體積，0.2ml；V 樣總：上清液總體積，1 ml；V 樣：加入反應體系中上清液體積，20μl=0.02 ml；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/ml；W：樣品質量

b. 使用 96 孔板測定的計算公式如下

GSH 標準曲線公式：y=0.75x（x 為GSH 濃度，μ mol /ml；y 為吸光值）

（1） 按蛋白濃度計算

GSH（μ mol/ mg prot）=(A2－A1) ÷0.75×V 樣÷V 樣÷Cpr =1.334×(A2－A1) ÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

GSH（μ mol/g 鮮重）=(A2－A1) ÷0.75×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W)=1.334×(A2－A1) ÷W

（3） 按細胞數量計算

GSH（μ mol /10⁴ cell）=(A2－A1) ÷0.75×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×細胞數量)=1.334×(A2－A1) ÷細胞數量

（4） 按液體體積計算

GSH（μ mol/ ml）=(A2－A1) ÷0.75×V 反總÷V 樣 =1.334×(A2－A1)

V 樣總：上清液總體積，1ml；V 樣：加入反應體系中上清液體積，20μl=0.02 ml；Cpr：上清液蛋白質濃度，mg/ml；W：樣品質量，g。

注意事項：

1. 試劑一中含有蛋白質沉淀劑，因此上清液不能用于蛋白濃度測定。

2. zui低檢出限為 0.011mmol/L。

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