谷an酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性測定試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

GLS（EC 3.5.1.1）是酰胺基水解酶，催化天冬酰an水解成谷an酸和氨，在氮素代謝中具有重要調控作用，尤其是調節游離氨含量和尿素代謝。

測定原理：

GLS 催化谷an酰胺水解成 L-谷an酸和氨，利用奈氏試劑檢測氨增加的速率，即可計算其酶活性。

谷an酰胺酶活性測定試劑盒   氮代謝系列

組成：

具體產品的參數以收到產品說明書的參數為準

自備儀器和用品：

臺式離心機、酶標儀、96 孔板、可調式移液槍、研缽、冰和雙蒸水。

粗酶液提取：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數量（10⁴ 個）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 試劑一），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 420nm。

2、樣品測定（在 EP 管中加入下列試劑）：

混勻，37℃水浴 1 小時

混勻，8000 g，25℃離心 10 min；取上清液，在 96 孔板中加入下列試劑

混勻，室溫靜置 15min，420nm 處讀取測定管和對照管吸光值，計算ΔA=A 測定管-A 對照管。對照管只要做一管。

注意：

1、試劑六如出現沉淀，靜置后取上清使用。

2、ΔA（A 測定管-A 對照管）若出現負值，可能是酶活性較低，可將反應時間 1h 延長到 2h，相應的在計算公式中除以 2。

酶活性計算：

標準條件下測定的回歸方程為y = 1.9244x + 0.0057，R² = 0.9983；x 為標準品濃度（μmol/ml），y 為吸光值A。

1、血清（漿）GLS 活性

單位定義：每 ml 血清（漿）每 min 催化谷an酰胺生成 1nmol 氨定義為一個酶活力單位。GLS(nmol /min /ml)

＝ (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V 反總÷V 樣÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)

2、組織、細菌或細胞 GLS 活性

（1） 按樣本蛋白濃度計算：

單位定義：每mg 蛋白質每min 催化谷an酰胺生成 1nmol 氨定義為一個酶活力單位。

GLS(nmol /min /mg prot)＝ (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)÷Cpr。

（2） 按樣本鮮重計算：

單位定義：每g 組織每min 催化谷an酰胺生成 1nmol 氨定義為一個酶活力單位。

GLS(nmol/min /g 鮮重)＝(ΔA-0.0057)÷1.9244×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)÷W。

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位定義：每 1 萬個細菌或細胞每min 催化谷an酰胺生成 1nmol 氨定義為一個酶活力單位。

GLS(nmol/min/10⁴ cell)＝(ΔA-0.0057)÷1.9244×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T ×1000 =0.7274×(ΔA

-0.0057)

V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時間，60min；V 反總：反應體系總體積，1.05ml；V 樣：加入反應體系中樣本體積，0.025ml；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數， 500 萬; 1000，μmol 到nmol 換算系數。

谷an酰胺酶活性測定試劑盒   氮代謝系列