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檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）試劑盒說明書
微量法 100 管/48 樣
CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體基質中，是三羧酸循環第一個限速酶，是三羧酸循環主要調控位點之一。
CS 催化乙酰CoA 和草酰乙酸產生檸檬酰輔mei A，進一步水解產生檸檬酸；該反應促使無色的DTNB轉變成黃色的TNB，在 412nm 處有特征吸光值。
產品名稱 | BE6008-100T/48S | Storage |
試劑一：液體 | 100ml | -20℃ |
試劑二：液體 | 20ml | -20℃ |
試劑三：液體 | 1.5ml | -20℃ |
試劑四：液體 | 28ml | 4℃ |
試劑五：粉劑 | 1 瓶 | 4℃ |
試劑六：粉劑 | 1 支 | -20℃ |
說明書 | 一份 | |
試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存，臨用前加入 1.2ml 蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存；
可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水
組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：
稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞，加入 1ml 試劑一和 10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。將勻漿 600g，4℃離心 5min。
棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。
上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的CS（此步可選做）。
在步驟④的沉淀中加入 200μl 試劑二和 2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3秒，間隔 10 秒，重復 30 次），用于線粒體CS 測定。
1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調節波長至 412nm，蒸餾水調零。
2、樣本測定
（1） 在試劑五中加入 0.6ml 無水乙醇和 13ml 試劑四，混勻，37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）孵育 5min；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復凍融；
（2） 測定管：在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本、220μl 試劑五和 10μl 試劑六，混勻，37℃反應 15min 后立即測定吸光值A1。
（3） 對照管：在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本、220μl 試劑四和 10μl 試劑六，混勻，37℃反應 15min 后立即測定吸光值A2。
（4） 計算ΔA=A1-A2，每個測定管設一個對照管。
（1） 按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。 CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=117.6×ΔA÷Cpr此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
（2） 按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g 組織每分鐘催化產生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。
CS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T=23.8×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。
CS（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=0.0475×ΔA
V 反總：反應體系總體積，2.4×10-4 L；ε：TNB 摩爾消光系數，1.36×104 L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應時間，15 min；Cpr：樣本 蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500 萬。
（1） 按樣本蛋白濃度計算：
單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。 CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷(V 樣×Cpr) ÷T=235.3×ΔA÷Cpr此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。
（2） 按樣本鮮重計算：
單位的定義：每g 組織每分鐘催化產生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。
CS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T=47.5×ΔA÷W
（3） 按細菌或細胞密度計算：
單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產生 1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。
CS（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×109]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=0.095×ΔA
V 反總：反應體系總體積，2.4×10-4 L；ε：TNB 摩爾消光系數，1.36×104 L / mol /cm；d：96 孔板光徑，0.5cm； V 樣：加入樣本體積，0.01 ml；V 樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應時間，15 min；Cpr：樣本 蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500 萬。
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